DNA İZOLASYONU

DNA izolasyonu, kısa bir tanımla deoksiribonükleik asidin yani DNA’nın normalde bulunduğu hücreden, ortamdan ya da virüsten uzaklaştırılması işlemidir [1]. Bu işlem genellikle çevrede bulunan bakteri ve virüsleri tespit etmek, hastalık ve genetik bozuklukları teşhis etmek için kullanılan yöntemlerde kullanılan ilk adımdan birisidir. Bu tekniklere örnek verecek olursam;

  • FISH(Fluorescene In Situ Hybridization): FISH, spesifik bakteri gruplarını tanımlamak ve numaralandırmak için kullanılan moleküler bir tekniktir.
  • T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphisim): T-RFLP, deniz bakteriyoplankton topluluklarında uzamsal ve zamansal kalıpları tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılır [2].

DNA izolasyonu üç temel adımdan oluşur. Bunlar, lizis, çökeltme ve saflaştırmadır. Lizis işleminde, hücre ve çekirdek, içindeki DNA’yı serbest bırakmak için kırılır ve bunu yapmanın iki yolu vardır. İlk olarak,  mekanik bozulma  kırılmaları hücreleri açar. Bu, bir doku homojenizatörü (küçük bir karıştırıcı gibi), bir harç ve havaneli ile veya dokuyu küçük parçalar halinde keserek yapılabilir. Mekanik bozulmalar, bitki hücreleri kullanılırken özellikle önemlidir çünkü sert bir hücre duvarına sahiptirler. İkinci olarak,  lizis  DNA’yı serbest bırakmak ve hücresel proteinleri çözmek için Proteinaz K gibi deterjanlar ve enzimler kullanır. Lizis adımında sonra çökeltme işlemi, DNA’yı çekirdekten ayırır, sonra da DNA’yı ezilmiş hücre parçaları ile karıştırmaktadır. Çökeltme, DNA’yı bu hücresel enkazdan ayırır. İlk olarak, Na + iyonları, DNA molekülleri üzerindeki negatif yükleri nötralize eder, bu da onları daha kararlı ve daha az suda çözünür hale getirir. Daha sonra, alkol (etanol veya izopropanol gibi) ilave edilir ve DNA’nın sulu çözeltiden çökelmesine neden olur, çünkü DNA alkolde çözünmez. Üçüncü aşamada ise saflaştırma gerçekleşir. Saflaştırmada, DNA, sulu fazdan ayrıldığı için, istenmeyen herhangi bir materyali ve hücresel kalıntıları çıkarmak için alkolle durulanabilir. Bu noktada saflaştırılmış DNA, kolay kullanım ve depolama için genellikle suda yeniden çözündürülür [3].

Görsel 1: DNA İzolasyonu [6]

DNA izolasyonu için yaygın olarak kullanılan dört izolasyon prosedürü vardır :

  • Organik (fenol / kloroform varyasyonları): Bu işlem, yüksek verim ve çok temiz çift sarmallı ekstrakte DNA örneği üreten çok aşamalı bir sıvı kimyasal işlemin kullanılmasıdır.
  • İnorganik Chelex veya silika yöntemleri: Bu işlem, Mg2+ ‘nın reçine boncuklarına bağlandığı ve tek iplikçikli bir DNA ürünü verdiği basit ve ucuz tek tüplü izolasyon yapılmasıdır.
  • Katı faz izolasyon işlemi ve Qiagen’in QIAamp kitleri: Bu işlem, DNA’nın paramanyetik veya silika taneciklerine bağlandığı basit izolasyon yapılmasıdır.
  • Diferansiyel izolasyon: Bu işlem, spermi DTT kullanarak diğer hücrelerden ayırmak için kullanılan çok aşamalı bir süreç; cinsel saldırı vakalarından biyolojik kanıtları analiz etmek için kullanılır [1].

Kısmen bozulmuş DNA içeren arkeolojik örneklere de izolasyon işlemi yapılabilir ve bu örneklere aDNA ismi verilmiştir. aDNA’ya çeşit olarak müze örnekleri, mumyalanmış dokular, fosiller, arkeolojik kazılardan elde edilen biyolojik örnekler gösterilebilir. Bu yöntemde amaç, geçmişin evrimsel tarihini yeniden canlandırma, soyu tükenen canlılar ile günümüz türleri arasındaki bağlantının çözümlenmesi, göçlerin, yer değiştirmelerin incelenmesi, eski toplumlara ait beslenme, enfeksiyon hastalıkları  ve kalıtımsal  anomalilerin incelenmesi, evcilleştirme sürecinin anlaşılmasıdır[4],[5].

NOT: Size  kaynakça kısmında 5. linki size öneri olarak bırakıyorum. Size bıraktığım linkte, yaşları 4 ila 13.000 yıl arasında değişen ve iki soyu tükenmiş hayvan (keseli kurt ve dev zemin tembellik) de dahil olmak üzere dört türü temsil eden yumuşak dokuların kuru kalıntılarından ekstrakte edilen DNA’da çeşitli kimyasal ve enzimatik özelliklerin incelendiği deneyin makalesini bırakıyorum ve incelemenizi tavsiye ediyorum.

KAYNAKÇA

  1. DNA Extraction, Kelly M. Elkins, in Forensic DNA Biology, 2013
  2. DNA Extraction, George Rice, Montana State Üniversitesi
  3. The Basics Of DNA Extraction, Alaska Fairbanks Üniversitesi,
  4. Antik DNA (aDNA) Çalışmaları, Doç.Dr. Yeşim Doğan Alakoç, Ankara Üniversitesi DTCF Antropoloji Bölümü (pptx dosyası)
  5. Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification, S Pääbo ,  1989 Mart, PMID: 2928314
  6. Transiom Genomics DNA Extraction Kit

Facebook Yorumları

Bu makaleyi 4 dakikada okuyabilirsiniz.
Bu gönderiyi beğendiniz mi ?
  • Fascinated
  • Happy
  • Sad
  • Angry
  • Bored
  • Afraid

Bir Cevap Yazın