BİTKİ HÜCRELERİNDE MİKRO FIRLATICI PARTİKÜL BOMBARDIMANI TEKNİĞİ İLE GEN TRANSFERİ(BİYOLİSTİK)

İpek Şahin 29 Şubat 20205 Mart 2020 0 Comments #BİYOLİSTİK, BİYOTEKNOLOJİ, molekülerbiyoloji

Partikül bombardımanı ya da gen tabancası tekniği olarak da bilinen biyolistik yöntemi; Yüksek derecede hızlandırılmış mikro-taşıyıcı adı verilen 1-2 mm çapındaki metal (çoğunlukla altın ya da tungsten) partiküller aracılığıyla, bir ateşleme mekanizmasından yararlanılarak DNA’nın hedef dokulara aktarılmasıdır.

Yöntem başlangıçta, Agrobacterium aracılığıyla transformasyona dirençli monokotillerin transformasyonunu sağlamak amacıyla denenmiştir .1987’de Cornell Üniversitesi’nde tahıllarda gen aktarımının üstesinden gelebilmek için geliştirilmiş olsa da hemen hemen tüm bitkilerin tüm doku tipleri için uygundur . Agrobacterium aracılığıyla transformasyon dışında en çok kullanılan transformasyon yöntemidir.

Başlangıçta hedef olarak bitki dokusu kullanılarak geliştirilmiştir, ancak maya, bakteri, memeli hücre çizgileri ve böceklerle de kullanılabilir. Bitkilerde, yabancı DNA’yı kloroplastlara ve genomik DNA’ya sokmanın birkaç yolundan biridir. Gen tabancası olarak adlandırılır, çünkü küçük DNA kaplı parçacıkları (genellikle yoğun oldukları için altın veya tungsten parçacıkları) hedef hücrelere ateşler. Bu yönteme “biyoloji” ve “balistik” kelimelerinin bir kombinasyonu olan biyolistik denir. Parçacıkların hızını ayarlayarak, herhangi bir hücre duvarı türüne nüfuz edilebilir. Yabancı DNA’yı hücrelere sokmak ve böylece hedef hücreleri dönüştürmek için etkili bir yöntemdir.

Doğrudan transformasyon yöntemleri içinde oldukça popüler olmasının sebebi; biyolistik yönteminin birçok tür, organel, bakteri, fungus ve hatta hayvansal hücrelerde kullanılabilmesi, sürecin kısa sürede tamamlanması, transgenik bitki üretiminin düşük maliyet gerektirmesi,çoklu genlerin veya kimerik DNA’nın (farklı organizmalardan ve homolog olmayan kaynaklardan gelen DNA’ların birleşmesi) aktarım kolaylığıdır.

1987 sonlarında kurulan parçacık bombardıman sistemi (yani gen tabancası), genin hedef dokulara fiziksel olarak verilmesi için en iyi yöntemlerden biridir ve yüksek basınç prensibi üzerinde çalışır. Ayrıca, gen tabancası, küçük miktarlarda gen verilmesi için hızlı, basit ve esnek bir yöntemdir ve zayıf toksisite profili ile istenen transkripsiyon sonuçları sağlar . Gen tabancası ilk önce bitkilerde gen transformasyonu için kullanıldı ve daha sonra memeli türlerinde in vivo transformasyon deneyleri için olduğu kadar in vivo ve in vitro gen relokasyonu için de uygulandı .

Gen Silahı Nasıl Çalışır?

Bir gen dağıtım aracı üzerinde bir yük olacaksa, verilen polinükleotitlerle etkileşime izin vermek için kesinlikle pozitif bir yük olması gerekir. Bu durumda, pozitif olarak iyonize oldukları ve biyolojik olarak inert oldukları için altın mikropartiküller kullanalır. Altın parçacıklarını DNA ile kaplanır ve daha sonra kaplanmış mikropartikülleri bir membrana yüklenir. Membran gen tabancasına yüklendikten sonra, filtreyi tabancanın namlusuna taşımak için ani bir kuvvet uygulaması kullanılır. Kuvvet, 200-300 psi mertebesinde bir basınçta helyum gibi sıkıştırılmış, atıl bir gazdan gelir. Parçacıklar yüklü zar, zarın daha fazla hareket etmesini önleyen bir konuma gelene kadar tabancanın namlusundan aşağı doğru hareket eder. Bununla birlikte, zar namlu içindeki bariyere çarptığında, momentum kuvveti altın nanoparçacıkların zardan çıkmasına izin verir ve hücreler ve / veya doku ile etkileşmek için namlu boyunca ve ötesinde hareket etmeye devam eder. Parçacıkların bazıları tamamen hücrelerin dış katmanlarından geçer Onlar geçtikçe, DNA’nın bir kısmı basit kesme kuvvetleri tarafından altından çıkarılabilir. Bazen bütün bir parçacık bir hücre içine gömülü olarak kalır. Sonuç, DNA’nın plazma zarından geçerek sitoplazmaya veya çekirdeğe iletilmesidir.

Gen tabancası sisteminin daha yaygın iğne enjeksiyon sistemine göre bir takım avantajları vardır. Genin çeşitli dokularda doğrudan transferini kolaylaştırır, hücre duvarı gibi bariyerlerin üstesinden gelir ve bu gen transferi, hücre yüzeyindeki hücre, reseptör ve molekül türlerinden etkilenmez. Ayrıca, hedef hücrelerin sitoplazmasına girmeye ve endozom ve lizozomlardaki ve nükleer engellerdeki enzimleri atlamaya zorlandıkları için genin bozulması azalır. Ek olarak, gen tabancası birkaç genin aynı hedef dokulara aynı anda verilmesine izin verir, bu da gen ürünleri arasındaki etkileşimin incelenmesini sağlar. Gen tabancası az miktarda DNA’yı verimli bir şekilde verdiğinden, DNA aşılaması için umut verici bir yaklaşımdır.

Gen tabancası hızlı, basit, esnek ve kolay fiziksel erişilebilirlik sağladığı için, DNA’yı cilt ve kaslar gibi çeşitli biyolojik sistemlere sokmak için yaygın olarak uygulanabilir. Gen tabancası ayrıca korneaya özgü keratin 12 promotör geni gibi promotör genleri tanımak ve hücrelerdeki ekspresyon mekanizmasını anlamak için de yararlıdır . Ayrıca kornea epitelinde opioid büyüme faktörünün etkisinin değerlendirilmesinde de yararlıdır . Bu teknik, CTLA-4 veya IL-4 kodlayan plazmidler ile greft sağkalım süresinin saptanması için de uygulanabilir. Gen tabancası iletiminin önemli bir uygulaması olan genetik aşılama, bağışıklık tepkisini ortaya çıkarmak için hedef dokulara DNA iletilmesinden oluşur. Günümüzde dermal DNA aşısı, antijeni sunma ve T hücresi aracılı bağışıklığı ortaya çıkarma kabiliyetine sahip yoğun Langerhans hücreleri ağı nedeniyle en kullanışlıdır . Aşılamada DNA, deri veya kaslar gibi dokulara, gen tabancası veya kas içi yolla sokulur. Kas içi yol yoluyla bağışıklık kazandırma (çoğunlukla IgG2a anti-H1 Ab ile ağırlıklı olarak Th1 tepkisi), bir gen tabancası (çoğunlukla IgG1 anti-H1 Abs ile Th2 tepkisi) ile taşınan bağışıklık tepkisinin tipine göre farklıdır . Bununla birlikte, birlikte kullanıldığında, bu iki yaklaşım çok etkili bir bağışıklama ortaya çıkarmaktadır. Gen tabancasının domuzlarda deri , al yanaklı maymunlar ve atlar gibi dokuların genetik aşılanmasında uygulanmasının, hayvanların hümoral ve hücresel bağışıklık tepkilerini ortaya çıkardığı bulunmuştur. Gen tabancası, farelerde influenza virüsüne karşı bağışıklığı arttırmak için plazmid DNA’yı başarılı bir şekilde vermek için kullanılmıştır ve bu yolun, kas içi veya intravenöz enjeksiyon gibi diğer yollara kıyasla en yüksek etkinliği gösterdiği bulunmuştur.

Biyolistik Yönteminde Gen Aktarım Frekansını Etkileyen Faktörler

Partikül hızlandırmada kullanılan helyum gazının basıncı: Gaz hızlandırma tüpündeki helyum basıncı, mikro-partiküllerin hızının belirlenmesinde etkilidir. Partikülü hızlandırmak amacıyla, kullanılan dokunun özelliğine bağlı olarak 450 ile 2200 psi basınç uygulanır. Ancak, çoğu hücre tipi için optimal basınç 1000 psi olarak belirlenmiştir. Bu değerden daha yüksek basınçlarda hücrelerde yaralanma düzeyi artar ve gen aktarım frekansı düşer.

Mikrotaşıyıcının boyutu, tipi ve sayısı: Tungsten partiküllerin ortalama çapları m olup, optimum boyut hedef hücrelerin çapı ile ilişkilidir. Ancak 1.0 m çaplı partiküllerin, başarılı geçici ve stabil transformasyonlar için uygun olduğu saptanmıştır. Tungsten partiküllerinin kullanımının dezavantajları; düzensiz şekil ve boyutta olmaları, belli hücre tipleri için toksik etki göstermeleri ve DNA çökelmesi ile sonuçlanabilecek yüzey oksidasyonuna neden olmalarıdır. Uniform boyutta olan altın partikülleri ise tungstenden daha pahalı olmalarına karşın daha az toksik etkiye sahiplerdir.

Makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki uzaklık: Maksimum etkinlikte transformasyon elde etmek için makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki uzaklık (uçuş mesafesi) önemli bir parametredir. Her hücre tipi için bu mesafenin deneme yoluyla belirlenmesi gerekmekle birlikte, pek çok örnekte 10 mm’lik uçuş mesafesi kullanılarak yüksek transformasyon frekansı elde edilmiştir.