Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nedir Ve Nasıl Yapılır?

PCR – POLİMERASE CHAİN REACTİON

Basitçe in vitro koşullarda belirli DNA parçasının enzimatik olarak kopyalanması ve çoğaltılması yöntemidir.1985 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilen bu teknik, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü kazandırmıştır. Moleküler biyolojide sıkça kullanılır.
Bu teknik sayesinde seçilen DNA dizisi çoğaltılırken diğer diziler baskılanır. Böylece istenilen DNA dizisinin tanımlanması kolaylaşır. Çok az DNA parçasıyla bile çalışmaya olanak sağlar ve gereksiz radyoaktif kullanımı da elimine edilmiş olur.

Bir ısıl döngüleyici ve programlanabilir su banyosu sayesinde gerekli olan sıcaklıklar ayarlanabilir. Ancak günümüzde bunun için tek bir makine işlev görmektedir ve bu PCR makinesinde de istenilen sıcaklıklar ve süreleri ayarlanarak döngüler gerçekleştirilir.

 PCR ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi edinilebilir:
1. Hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi
2. Başlangıç materyali olarak kullanılan DNA veya RNA’nın kabaca ya da kesin miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi
3. Dizi analizi
PCR’da üç temel basamaktan oluşur.
1.DENATÜRASYON 94C-98C / 15 saniye : Yüksek sıcaklıklarda DNA sarmalının birbirinden ayrılması.
2.ANNEALİNG (hibridizasyon) 37C-65C / 30 saniye : Uygun reaksiyon koşullarında primerlerin istenilen bölgeye bağlanması.
3.EXTENSİON (uzama) 72C / 1.5 saniye :  Mg iyonları varlığında sıcaklığın da yükselmesiyle Taq DNA polimeraz primerleri uzatır ve yeni DNA zincirleri sentezlenir.

Çoğaltılmış ürün miktarı bu üç adımın tekrarlanma sayısını bağlıdır.
DNA sarmalının yüksek sıcaklıklarda birbirinden ayrılmasıyla denatürasyona uğrar. Daha sonra sıcaklık düşürülür. Bu sayede primerler çoğaltılacak DNA parçası üzerindeki dizilere bağlanırlar. DNA polimeraz enzimi yüksek sıcaklıklarda çalışabilir ve PCR döngüsü sırasında zincirin açılması için kullanılan sıcaklığa dayanabilir. Primerlerin bağlanmasıyla sıcaklık düşürülür ve polimerizasyon tepkimesi gerçekleşmesi sağlanır. Bu polimerizasyon tepkimesi uzama evresidir. Primerler uzatılır ve primerlerin arasında kalan bölge sentezlenir. DNA zinciri tekrar denetüre edilir, yeni primerler bağlanır ve DNA sentezi tekrar tekrar gerçekleşir. Bu işlemler 20 ile 50 döngü arasında yapılır. Böylece her PCR döngüsü DNA parçası üzerinde bulunan istenilen bölgenin iki katına çıkmasıyla sonuçlanır.

KULLANILAN MALZEMELER:

1. Distile su
2. Buffer (tampon çözeltisi-1XTBE) ve MgCl2
3. Dinükleotittrifosfatlar (dNTP)
4. Primerler (forward ve revers)
5. Taq DNA polimeraz
6. Çoğaltılmak istenen DNA (kalıp-template DNA)

Başlangıçtaki DNA molekülü sayısı PCR’ ın kaç döngü uygulanacağını belirler. 1 – 100 kopya DNA molekülü ile başlanıyorsa 30 – 45 döngü, 1.000 – 100.000 ile başlanıyorsa 20 – 30 döngü yeterlidir. Bir döngü sonucunda başlangıçta n olan DNA zincir sayısı 2n’ e yükselir. Döngüler arka arkaya çok kez tekrarlanırken her bir döngünün ürünü, bir sonrakinde kalıp olarak kullanıldığı için her döngüde istenen DNA fragmenti miktarı 2 katına çıkar.
PCR’a başlamadan önce primer dizaynı yapılmalıdır. İstenen bölgenin çoğaltılması için o bölgeye özgü primerler yapılır. Primer boyutu 18-22 baz çifti arasındadır. Daha düşük sayıda primer üretilirse primerin özgüllüğü azalır, yükseltilirse de primerin bağlanması kalıp DNA’ya bağlanması güçleşir.
Primerlerin annealing derecelerinin hesaplanması:
• 2 (A+T)+4 (G+C)
Örnek dizi: 5’-ccttaagctggtgtccaaat-3’
2(11AT)+4(9GC)=58ºC 5’-gctagcaatatttgtaagcat-3’
2(14AT)+4(7GC)=56 ºC

PCR’da Önemli Bileşenler

1.KALIP DNA

Çoğaltılacak bölgeye üzerinde taşıyan DNA’dır. Bu bölge için kalıp olma görevi vardır. PCR’de; genomik DNA’lar, plazmid ve faj DNA’ları çeşitli genler ve hatta herhangi bir DNA parçası kalıp olarak kullanılabilir. PCR’de kalıp olarak DNA’nın yanı sıra RNA’da kullanılabilir. Bu kalıp DNA’lar amaca göre cDNA, genomik DNA, genom kitaplıkları şeklinde ya araştırma laboratuarları yada kliniklerden ticari olarak temin edilebilir.

2.DNA POLİMERAZLAR
Bu enzimler kalıp DNA’ya bağlanmayı kolaylaştırıp, yeni bir iplik oluşturmak üzere uzun polipeptidten zincirin sentezini kataliz eder. Sentezi başlatmak için primerlere ihtiyaç duyarlar. 5 ’ uçtan 3 ’ uca doğru, primerin serbest 3 ’ hidroksil ucuna ortamdaki dNTP’lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanmış olur.

3.PRİMERLER

Reaksiyonun özgülüğü primer oligonükleotidlerin seçilmesiyle sağlanır. Bunlar amplifiye edilecek DNA’ ya bağlanacak olan bağlanma bölgesine komplementer yapıda kısa tek sarmal DNA molekülleridir. Primerler çiftler halinde biri çift zincir DNA’yı oluşturan zincirlerinden birine, diğeri de o zincirin komplementerine eşleşecek şekilde farklı dizilimlerde tasarlanırlar. Amplifikasyon için DNA dizisinin bilinmesi gerekli değildir. Birleşme bölgelerinin dizisinin bilinmesi yeterlidir.

Reaksiyon için ısıya dayanıklı bir enzim Taq DNA polimeraz Klenow fragmenti kullanılırken günümüzde “Thermus aquaticus” adlı termofilik bakterisinden izole edilen ve ısıya dayanıklı enzim olan Taq polimeraz kullanılmaktadır. Çünkü bu enzim 94C’de inkübe edildikten sonra bile aktivitesini kaybetmez. Fakat E.coli’den elde edilen DNA polimeraz I yüksek sıcaklıkta inaktive olur ve her döngüde enzimi yenilemek gerekir. Bu yol hem yavaş hem pahalıdır. O yüzden Taq polimeraz kullanılır. DNA polimeraz enzimleri bir DNA sentezleyebilmek için komplementerini sentezleyeceği bir kalıp DNA molekülüne, substrat olarak dNTP’ lere ve kalıp zincirine eşleşmiş primerin 3’OH grubuna ihtiyaç duyarlar. Enzim bu bileşenlerin bir araya geldiği uygun tampon sisteminde ve uygun sıcaklıkta primerin 3’OH grubuna serbest dNTP’ lerin 5’a -fosfat gruplarını 3’-5 fosfodiester bağı ile kovalent olarak bağlar.

4.dNTP KARIŞIMI

Deoksirübonükleozid trifosfatlar (dATP,dGTP,dTTP,dCTP) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak bulunur. DNA sentezi için gereklidir.

5.TAMPONLAR VE MAGNEZYUM

Tamponlar, enzim için gerekli olan elektrolitleri ve koenzimleri sağlar. Yine polimeraz enzimleri aktiviteler için serbest magnezyum iyonlarına gereksinim duyarlar. Bu yüzden magnezyum içeren tamponlar kullanılır.
Tampon çözeltisinin içeriği kullanılan enzimin tipi ve özelliğine göre seçilir. PCR’de en çok kullanılan tampon Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur.
Mg+2 iyonları;

1. dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar.
2. Polimeraz aktivitesini arttırır.
3. Çift iplikli DNA’nın Tm (erime noktasını) değerini arttırırlar.
4. Primer/kalıp etkileşimini sağlarlar.

Bu yüzden MgCl2 ’ün PCR’nin özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mM’lık değerler tercih edilir.düşük Mg+2 konsantrasyonu; ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg+2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl2 kullanımına gerek yoktur.

KULLANIM ALANLARI

-En çok kullanılım yeri DNA dizi analizleridir. Büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında,
-Bilinmeyen dizi tayininde,
-Evrimin aydınlatılmasında,
-İn vitro fertilization yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında,
-DNA-protein interaksiyonunun araştırılmasında ve daha birçok yerde kullanılır.

İstediğimiz DNA parçasının çoğalıp çoğalmadığını kontrol etmek için basit olarak elektroforez yapılabilir. Eğer elektroforez sonrası boş bir jel gördüğümüzde üç şeyi kontrol etmemiz gerekir:
1-Primerler
2-Annealing sıcaklığı: Azaltmak gerekir.
3-Magnezyum konsantrasyonu: Artırmak gerekir.
PCR’da verim alabilmek için:
1. Taq DNA polimeraz : Enzim miktarı önemlidir. 25-30 döngü sonrası hedef dizinin artması ve termal denatürasyon nedeniyle sınırlayıcı etken haline gelir.
2. DNA kontaminasyonu: Pipetleme sırasında aerosol oluşumu. Memeli DNA’sının kontaminasyonunu sağlayan diğer etkende deri hücreleridir. Eldiven giyip çıkarırken dikkat edilmelidir. Ayrıca DNA konsantrasyonunun çok miktarda bulunması zayıf amplifikasyona neden olur az miktarda bulunması da non-spesifik üretime neden olmaktadır.
3. Primer konsantrasyonu: Yüksek konsantrasyonda primerler dimer denilen yapılar oluşturup yanlış bağlanma olasılığını arttırır.

4. Magnezyum konsantrasyonu: fazla miktarlarda bulunması non-spesik ürün oluşumuna yol açar. Az miktarlar ise ürünün yeterince sentezlenmemesine sebep olur.
5. dNTP konsantrasyonu : az miktarlarda olması yine yeterince sentezlenmemesine ve çok miktarlarda olası ise non-spesifik ürün oluşumuna neden olur.
• Bunların dışında örnekler PCR makinesinin uzağında hazırlanmadır.
• DNA’yı tüm PCR tüplerini en son koyulmalıdır.

 KAYNAKLAR VE İLERİ OKUMA:

http://dergipark.gov.tr/download/article-file/187473
http://bys.trakya.edu.tr/file/open/44259122
https://tr.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
http://www.filocografya.net/uploads/9/6/6/2/9662576/pcr_can_elverici.pdf