Hızlı, ucuz, son derece hassas CRISPR tabanlı tanılama aracı SHERLOCK’u ilk kez ortaya çıkaran ekip, aracın gücünü büyük ölçüde geliştirdi ve sonuçların pahalı ekipmanlara gerek kalmadan çıplak gözle görülebilmesini sağlayan minyatür bir kağıt testi geliştirdi. .
SHERLOCK ekibi, test sonuçlarını tek bir genetik imza için göstermek için basit bir kağıt şeridi geliştirdi, hamilelik testlerinde olduğu gibi görsel işaretlemeden ilham aldı. Kağıt şeridini işlenmiş bir numuneye batırdıktan sonra, hedef molekülün tespit edilip edilmediğini gösteren bir çizgi ile sonuç görüntülenir hale getirildi.
Bu yeni özellik, bir salgın sırasında olduğu gibi alan kullanımının önünü açmaya yardımcı olacak. Ekip ayrıca SHERLOCK’un duyarlılığını arttırdı ve bir örnekteki hedef miktarını doğru bir şekilde ölçme ve birden fazla hedefi bir kerede test etme kapasitesini ekledi. Hep birlikte, bu ilerlemelerin SHERLOCK’un örneklerde patojenleri ve tümör DNA’sı gibi genetik imzaları hızlı ve hassas bir şekilde algılama yeteneğini hızlandırdılar.
Açıklanan yenilikler, SHERLOCK’un daha önceki sürümüne dayanıyor. (Özgül Yüksek Hassasiyet Raportörünün kısaltılmış hali) ve gen düzenleme dışında kullanımlar içindir. Bu alan CRISPR sistemlerinden yararlanan büyüyen bir araştırma alanıdır. Harvard ve MIT’den araştırmacılar tarafından yürütülen çalışma, küresel halk sağlığı üzerinde dönüştürücü bir etki potansiyeline sahiptir.
Yazar Feng Zhang, “SHERLOCK, nükleik asit materyalini tespit etmek için ucuz, kullanımı kolay ve hassas bir teşhis yöntemi sunar; bu bir virüs, tümör DNA’sı ve diğer birçok hedef anlamına gelebilir” dedi.
McGovern Enstitüsünde bir araştırmacı olan James ve Patricia Poitras “SHERLOCK daki geliştirmeler şimdi bize daha fazla teşhis bilgisini veriyor ve bizi gerçek dünya uygulamalarında konuşlandırılabilecek bir araca yakınlaştırıyor.”
Araştırmacılar daha önce SHERLOCK’un bir dizi uygulama için faydalı olduğunu sergilediler. Yeni çalışmada ekip, diğer gösterilere ilaveten, akciğer kanseri hastalarındaki kan örneklerinde hücresiz tümör DNA’sını bulmak ve sentetik Zika ve Dengue virüsünü eşzamanlı olarak tespit etmek için SHERLOCK kullanıyor.
Bir kağıt şeridinde net sonuçlar
Yazar Jonathan Gootenberg “SHERLOCK için hazırlanan bu yeni kağıt okuma, hedefinizin enstrümantasyon olmadan numunede bulunup bulunmadığını görmenizi sağlar” dedi.
Zhang’ın laboratuvarındaki bir Harvard lisansüstü öğrencisi ve Broad core Enstitüsü üyesi Aviv Regev “Bu bizi sahaya hazır teşhis konusuna çok daha yakın hale getiriyor.”
Ekip, SHERLOCK için nükleik asit hedef algılamadaki çok yönlülüğü sayesinde geniş bir kullanım yelpazesi öngörüyor. “Teknoloji, hastalarda enfeksiyonların teşhisi ve uyuşturucuya direnç kazandıran veya kansere neden olan mutasyonları saptama da dahil olmak üzere pek çok sağlık uygulamaları için potansiyel olduğunu gösteriyor ancak tedarik zinciri boyunca izleme adımlarının atıkları azaltabileceği ve geliştirebileceği endüstriyel ve tarım uygulamaları için de kullanılabilir “diye ekledi.
SHERLOCK’un başarısının merkezinde, belirli bir RNA parçasına bağlanacak şekilde programlanabilen Cas13 adı verilen CRISPR’a bağlı bir protein bulunur. Cas13’ün hedefi viral genomlar, bakterilerde antibiyotik direnci veren genler veya kansere neden olan mutasyonlar dahil olmak üzere herhangi bir genetik dizi olabilir. Belirli koşullarda, Cas13 belirlenen hedefi bulup keserse, enzim üstü sürüklenerek yakınlardaki diğer RNA’yı kesintisiz olarak keser. SHERLOCK’u yaratmak için ekip bu “hedef dışı” aktiviteyi kullandı ve sistemin hem DNA hem de RNA ile uyumlu olacak şekilde bir mühendislik avantajına dönüştürdü.
SHERLOCK’un teşhis potansiyeli, ayrılmadan sonra bir sinyal yaratmak için kullanılan sentetik RNA’nın ilave bükümlerine dayanır. Cas13 orijinal hedefine ulaştıktan sonra bu RNA’yı parçalayarak sinyal molekülünü serbest bırakır ve hedefin varlığını veya yokluğunu gösteren bir okuma yapar.
Çoklu hedefler ve artan duyarlılık
SHERLOCK platformu artık çoklu hedefleri test etmek için uyarlanabilir. SHERLOCK başlangıçta yalnızca bir nükleik asit dizisini aynı anda algılayabilirdi, ancak şimdi bir analiz, aynı anda dört farklı hedefe yönelik floresan sinyalleri verebilir, bu da, teşhis panelleri üzerinden geçmek için daha az numune gerektirir. Örneğin, SHERLOCK’un yeni sürümü, bir örneğin, hastalarda benzer belirtilere neden olan Zika veya dang virüsü parçacıkları içerdiğini tek bir reaksiyonla belirleyebilir. Platform, ilave sinyalleri üretmek için farklı bakteri türlerinden Cas13 ve Cas12a (daha önce Cpf1 olarak bilinen) enzimleri kullanıyor.
SHERLOCK’un ikinci iterasyonu, algılama sinyalini yükseltmek için aracı daha öncülünden daha hassas hale getirmek için ek bir CRISPR ile bağlantılı enzim kullanıyor. Zhang’ın Broad’daki laboratuarındaki MIT lisansüstü öğrencisinden eş yazar Omar Abudayyeh “orijinal SHERLOCK ile bir mikrolitrede tek bir molekülü tespit ettik ancak şimdi 100 kat daha fazla hassasiyet elde edebiliyoruz” dedi. “Bu, özellikle hedeflenen konsantrasyonun aşırı düşük olabileceği kan örneklerinde hücre içermeyen tümör DNA’sının bulunması gibi uygulamalar için önemlidir. Bu yeni nesil SHERLOCK’u daha hassas bir sistem haline getirmeye yardımcı oluyor. “
Yazarlar, reaktiflerini Addgene aracılığıyla akademik topluluğa sunmuş ve yazılım araçlarına Zhang laboratuarı web sitesi ve GitHub aracılığıyla erişebiliyor.
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Savunma Tehdit Azaltma Ajansı tarafından desteklenmiştir.
Kaynaklar ve İleri Okuma:
”http://news.mit.edu/2018/researchers-advance-crispr-based-tool-diagnosing-disease-0215?utm_source=newsletter&utm_medium=email&utm_campaign=Neural%20networks%20everywhere%3B%20new%20form%20of%20light%3B%20conversation%20helps%20children%27s%20brain%20development%20”
Bu makaleyi 5 dakikada okuyabilirsiniz.
Moleküler Biyoloji ve Genetik
