Moleküler değişimlerin FTIR spektroskopisiyle nasıl belirlendiğini daha iyi anlamak için FTIR spektroskopisinin ne olduğu ve nasıl çalıştığına bakalım:
FTIR, organik (ve bazı durumlarda inorganik) malzemeleri tanımlamak için kullanılan analitik bir tekniktir. Temel prensipte, farklı elemanlar arasındaki bağların ışığı farklı frekanslarda emmesinden faydalanılır. Bu teknik, kızılötesi radyasyonun örnek materyal tarafından dalga boyuna karşı emilimini ölçer. Kızılötesi emme bantları moleküler bileşenleri ve yapıları tanımlar. FTIR spektrometresi geniş spektral aralıkta aynı anda yüksek spektral çözünürlüklü verileri toplar. Bu, bir seferde dar bir dalga boyu aralığındaki yoğunluğu ölçen dağıtıcı bir spektrometreye göre önemli bir avantaj sağlar. Aynı zamanda, boyama, işaretleme gibi ek maddelerin kullanımını içeren uzun örnek hazırlama prosedürlerine gerek duyulmadan, örneğe zarar vermeden hızlı, hassas ve etkin sonuçların göreceli olarak daha ucuz bir biçimde elde edilmesi sağlaması bakımından diğer tekniklerle karşılaştırıldığında daha avantajlıdır. Elektromanyetik ışık dizisinin kızıl ötesi bölgesi 14000 cm-1 ile 10 cm-1 arasındadır ve 3 ana bölgeden oluşur. Bu 3 bölgeden biri olan orta dalga boylu kızıl ötesi (MIR; 400~4000 cm-1) bölgesindeki bantlar ile hücre duvarı bileşenleri, proteinler ve nükleik asitler gibi bakteri hücrelerinin toplam bileşenleri belirlenebilir.
FTIR Bize Ne Tür Bilgiler Verir
Bu teknik kullanılarak, doku ve hücrelerde lipit, protein, DNA, RNA gibi biyomoleküllerdeki fiziksel, örneğin yapısal, değişimlerin izlenmesi mümkün olabilmektedir. Bu bilgiler, öncelikle doğru bant tanımlamalarının yapılması, sonrasında ise ilgilenilen bantların bant pozisyonu, sinyal şiddeti/alanı ve bant genişliği değerlerinin hesaplanması ile elde edilebilir.
FTIR pektrumlarından kimyasal konsantrasyon, kompozisyon, konformasyon ve içerilen fonksiyonel gruplar gibi pek çok kalitatif ve kaltitatif bilgi elde etmek mümkündür. Örneğin, değişik makromoleküllere ait fonksiyonel grupların konsantrasyonları aynı spektrumdan sinyal şiddeti ya da daha hassas olarak bant alanı hesaplanarak Beer-Lambert yasasına uygun olarak elde edilebilir. Buna ilaveten, bir örnekteki moleküllerin kompozisyonu sinyal şiddeti ya da ilgili bantların alanlarının oranlarının hesaplanması ile (doymamış lipitlerin doymuş lipitlere ya da lipitlerin proteinlere oranı gibi) hızla analiz edilebilir. Temel olarak lipitlerden kaynaklanan CH2 simetrik ve antisimetrik titreşimlerinin bant genişlikleri sistemin dinamiğini görüntülemek için kullanılabilir. Bant pozisyonlarındaki kaymalar ise yapısal değişimlere işaret eder. Örneğin, 3000-2800 cm-1 bölgesindeki C-H gerilme bant pozisyonundaki kaymalar lipitlerin düzen/düzensizliklerinde olan değişimler hakkında, 1730 cm-1 civarında görülen C=O gerilme bandının bant pozisyonundaki değişimler ise bu fonksiyonel grup etrafındaki hidrojen bağlanması hakkında bilgi verir. Bunun yanı sıra, kontrole karşı olarak yapılan ölçümlerde ana protein bantlarının (amid I) frekans değerlerindeki kaymalar ise proteinlerin yapılarında oluşabilecek değişimleri işaret eder. FTIR spektroskopisinin diğer önemli bir avantajı ise protein ikincil yapılarında oluşan bu değişimlerin 1650 cm-1 ve 1550 cm-1 civarında gözlenen sırasıyla amid I ve amid II ana protein bantları kullanılarak detaylı olarak incelenebilmesidir.
Dezavantajları
FTIR spektroskopisinin en önemli dezavantajı suyun kızılötesi dalgaboyunda kuvvetli bir sinyal vermek suretiyle FTIR spektrumunda baskın olması ve biyolojik sistemlerde başta protein bantları olmak üzere bazı bantları maskelemesidir. Su ile oluşan bu etkileşimi ve kısıtlamayı önleyebilmek için örnek hazırlama sırasında su yerine dötoryum oksit (D2O) kullanılabilir ya da örnekler kuru halde incelenebilir. Fakat, bu yöntemlerin de bazı dezavantajları bulunmaktadır. D2O kullanımında hidrojen ve dötoryum çok hızlı bir biçimde değişmekte ve kuru halde incelenen örnekler su içeren gerçek sistemi tam olarak yansıtmamaktadır. Bu yöntemlere göre daha fazla tercih edilen inceleme yöntemi ise örnekleri sulu ortamda çekilen örnek spektrumlarından kullanılan tampon çözelti spektrumunun dijital olarak çıkarılması ile uygulanan fark spektroskopisi yöntemidir.
FTIR Spekstroskopisindeki Genel Basamaklar
1- FTIR Spektroskopisi İçin Örnek Hazırlama
2- Spektral Analiz
a) Düzleştirme
b) Baseline Düzeltmesi
c) Dekonvolüsyon
d) Normalizasyon
3- Sonuç ve Değerlendirme
İleri okuma ve kaynaklar için;
https://acikders.tuba.gov.tr/course/view.php?id=49
https://dergipark.org.tr/en/download/article-file/78517
Bu makaleyi 4 dakikada okuyabilirsiniz.
Yönetici 