PLASMİD DNA’SI İLE BAKTERİYEL TRANSFORMASYON

Bakteriler Dünya üzerinde neredeyse her türlü koşulda, derin denizlerden insan sindirim sistemi de dahil, yaşama kabiliyetini elde edebilmiş olan tek hücreli canlılardır. [1]. Arkebakteriler olarak adlandırılan diğer organizma grubuyla birlikte ökaryot canlılar sınıfındam ayrılarak prokaryot sınıfını oluştururlar. Şekillerine göre sınıflandırılırlar. Dünya üzerinde sayıları tam olarak belirlenemeyen bu mikroorganizmaların sayılarının 5*10 üzeri 30 civarı olduğu tahmin edilmektedir[2]. Bu canlı grubunun ökaryotlardan ayrılmasının temel sebebi zarla çevrili çekirdeklerinin olmayışıdır ayrıca bu canlı grubunun ribozom hariç zarlı organeli de bulunmamaktadır[2]. Bakteriler hastalıklara sebep olan mikroorganizmalar olmakla beraber faydalı bakteri sayısı da oldukça yüksektir. Yararlı bakterilere örnek olarak  insan kalın bağırsağında yaşayan B ve K vitaminlerinin üretilmesini sağlayan bakteriler gösterilebilir. Silindirik bakterilerin boyutu hücre çapı olarak  ortalama olarak 0.5 ile 2.0 µm arasında değişkenlik gösterirken çubuk şeklinde veya iplik şeklindeki bakterilerin çapı 0.25 ile 1.0 mikrometre arasındadır( 1 mikrometre=10 üzeri -6 m)[3].

Tüm organizmaların işlevlerinin hücresel boyuttaki çalışması ve kontrol edilmesi mekanizması genetik materyal olarak adlandırılan yapılar tarafından gerçekleştirilir[4].Genetik materyal çoğunlukla kromozomal DNA olarak mevcuttur[4]. Ökaryotlarda DNA çekirdek denen zarla çevrilmiş bir yapı içersinde mevcutken bakteriler de dahil olan prokaryotlarda genetik materyal sitoplazmada bulunur[4]. Kromozomal veya genomik DNA haricinde, bazı organizmalarda; bakteri, arke ve mayalarda, ilaveten bir çesit DNA daha mevcuttur ve bu DNA plazmid DNA olarak adlandırılır[4]. Plazmid DNA sı çift zincirli, dairesel ve kapalı düğümler şeklindedir. Bakteriyel organizmalardaki plazmid DNA sı organizmanın işleviyle ilgili olarak gerekli olmasa da az sayıda gen içerebilir fakat bir bakteride plazmid DNA sı varlığı bu organizmalara fazladan yaşama kabiliyeti sunar antibiyotik direnci sağlaması bu faydalardan bir tanesidir. [4]. Bakteri içerisinde mevcut olan kromozomal DNA ve plazmid DNA’ sı Görsel 1 de gösterilmiştir.

Görsel 1. Bakteri içinde kromozomal DNA ve Plazmid DNA’sı[5].

Plazmid DNA lar ev sahibi olarak adlandırılan, içinde bulundukları mikroorganizmanın, kromosomal DNA sından bağımsız olarak kendini eşleyebilir[4]. Bakterilerde mevcut olan plazmid DNA  genetik çalışmalar ve biyolojik yöntemlere çok işlevsel kabiliyetler sunmaya başlamış ve bunun üzerine çaılşmalarda önemli yollar katedilmiştir ve bunların yapay olarak üretilmesine yönelik çalışmalar da gerçekleştirilmiştir. Laboratuar koşullarında üretilmeya çalışılan bu yapılarda yabancı bir DNA kısmının bakteri içindeki plasmid DNA ya eklenmesi amaçlanmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinde özellikle mühim yere sahip olan bu süreç Transformasyon olarak adlandırılmaktadır. Etkisinin veyahut da görevinin anlaşılması amaçlanan DNA parçaları(inserted(ek)-gene(gen)) transformasyon olarak adlandırılan bu yöntem vesilesiyle plasmid DNA ya kesilen bölgeden(restriction-site) aktarılıp birleştirme süreciyle de plazmid DNA sına birleştirilir. Bu süreç görsel olarak Görsel 2. de sunulmuştur.

Görsel 2. Transformasyon vasıtasıyla plazmid DNA sına eklenmiş gen bölgesimi de içeren  plazmid haritası[4].

Plazmid DNA yaygın olarak hedef hücrelerdeki gen ifadesinin kontrol sürecini kontrol etmek ve anlamak için kullanılırlar[4]. Laboratuar süreçlerindeki yapay plasmid DNA sı ayrıca “vektör” olarak da adlandırılır[4].

Transformasyon adı verilen biyolojik metod son zamanlarda biyoloji alanında yapılan çalışmalara farklı bir boyut getiren mühim bir ilerlemedir. Rekombinant DNA çalışmalarına ilerlemeler sağlamış bir yöntemdir. Transformasyon adı verilen süreç, yabancı bir DNA nın, önceden DNA izolasyonu ve PCR( polychain reaction- izole edilmiş DNA nın bu özel reaksiyonla çoğaltılmasıdır) yöntemleri uygulandıktan sonra etkisinin, gen ifadesi ve bu genin etkisi gibi, anlaşılması amacıyla ev sahibi(host) un DNA sına aktarılması sürecine genel olarak verilen isimdir. Bir DNA dizisinin, üzerinde çalışılacak olan DNA(yabancı DNA), ev sahibi bir hücre veya organizmaya aktarılabilmesi sürecinde plasmid DNA mühim bir rol oynamaktadır. Fakat tüm bunlardan da önce ilgilenilecek olan DNA nın ev sahibi hücreye alınabilmesi gerekmektedir. Bu gibi çalışmalarda kullanılan organizmaların yabancı bir DNA yı kendi hücresi içine alma kabiliyeti “kompetent” olarak adlandırılmıştır. Kompetent hücreler kendileri doğal olarak sahip olabileceği gibi laboratuvar koşullarında da yabancı DNA yı hücre içine, kendi DNA sı içine alabilecek duruma getirilebilirler; bu duruma is yapay kompetentlik adı verilir.

Yabancı DNA nın hücrelerin içine yerleştirilmesi çeşitli yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Fakat bu sürecin gerçekleştirilebilinmesi için ev sahibi hücrenin, yani bakterinin, yabancı geni alma yetisine sahip olması gereklidir, eğer kendiliğinden yabancı DNA alabilme yatisine sahip değilse bu durumda da yapay(sun Bu doğrultuda aılması amaçlanan çaılşmalarda i) olarak yabancı DNA hücre içine alınılabilecek hale getirilir. Bakteriler ve bazı ökaryot türler için plasmid veya fajlar uygun vektör yani uygun taşıyıcı olma özelliğini meydana getirir[6]. Taşıyabildikleri yani hücreleri içerisine aldıkları DNA segmentinin boyutu da değişkenlik göstermektedir. Plazmidler göreceli olarak daha küçük boyutlardaki, daha az baz çifti bulunduran, DNA parçalarını taşıyabilirler ve bu boyut genelde <10 kb dir.(kilobaz: 1kb=10³baz çiftidir)[6]. Fajlar ve kozmid vektörlerse 50 kb boyutuna kadarki DNA segmentlerini taşıybilmektedir[6].  Maya suni kromosomu (YAC-Yeast Artificial Chromosome) olarak adlandırılan vektör ise mayalarda çok daha büyük boyutlardaki DNA segmentleri için (≥200 kb) taşıyıcılık görevini yerine getirebilir[6].

Doğal transformasyon kabiliyeti sınırlı sayıdaki bakteriler tarafından gerçekleştirilebilmektedir[7]. Azotobacter vinelandii  doğal olarak kompetent olan, yabancı bir DNA yı kendi DNA sı içine alma kabiliyetine sahip, bir gram-negatif bakteri çeşididir[7]. Doğal kompetent kabiliyetinw sahip olmayan diğer çoğu mikroorganizma çeşitleri geliştirilen farklı teknikler vesilesiyle kompetent hale getirilebilir. Transformasyon sürecinin başlatılabilmesi için öncelikle bu işlemlerden birisi gerçekleştirilmeli ve yabancı DNA yı kendi DNA sı içine alabilecek hale getirilmelidir. Bu bağlamda yapay kompetentlik için çevresel parametreler devreye girmektedir. Çevredeki besin miktarı kompetantlık açısından mühim faktörlerden birisidir[7]. Bakterilerde kompetantlığın gelişebilmesi için üzerinde çalışmalar yapılacak olan bakterinin metabolik olarak aktif durumda olması gerekmektedir[7]. Her canlının optimum büyüme ve gelişme koşulları olduğu gibi bakterilerin de en uygun olarak ve en rahatça büyüdükleri ve geliştikleri koşullar mevcuttur. Transformasyonda kullanılacak hücrelerin bu süreci en yüksek başarı ile gerçekleştirilmesinin eldesi bu teknikteki temel hedeflerden birisidir. Bu bağlamda yapılan çalışmalar neticesinde anlaşılmıştır ki bakteriler çoğunlukla kısıtlı besin ortamında yaşamaya uyum sağlamıştır ayrıca yapılan çalışmalarla anlaşılmıştır ki açlık ortamları, kısıtlı limit ortamı, kompetantlığın gelişimine katkı sağlamaktadır[7].  Bu sebeple yapılacak çalışmalarda açlık ortamı olarak da adlandırılan kısıtlı besin ortamından alınacak bakteriler  transformasyon çalışmalarında daha aktif olarak kullanılabilecektir. Bu duruma örnek olarak nitrojen bağlayıcı bakterilerin kompetantlığının sadece demirin kısıtlı olduğu ortamlarda gelişiyorken bu durum diğer bakteri türlerinde farklı besin gruplarının eksikliği veya yokluğunda en yüksek seviyelerde gelişebilmesi verilebilir[7].

Plazmid DNA ile baktriyel transformasyon sürecinde doğal olarak veyahut laboratuvar koşullarında bakterilerin kompetanslığının sağlanmasının ardından ilgilenilen gen veyahut DNA segmentinin bakteri içerisine aktarılması süreci başlar. Bu aşamada kullanılabilecek birçok yol mevcuttur.  Bu yollar temel olarak fiziksel yöntemler, kimyasal yöntemler ve elektriksel yöntemler olarak üçe ayrılmaktadır. Pronüklear enjeksiyon ve biyolistik transformasyon fiziksel yöntemlerdendir. Kalsiyum Fosfat yöntemi, Polyethylene Glycol aracılığıyl ve liposome aracılığıyla transfer transformasyon için kullanılan kimyasal yöntemlerdendir. Elektroporasyon ise transformasyonda kullanılan elektriksel yöntemdir.[8].  Pronüklear Mikroenjeksiyon yöntemiyle küçük iğneler kullanılarak ilgili genin hücre içine aktarılması hedeflenir[8]. Fizikel transformasyonun bir diğer yolu olan biyolistikte, parçacık bombardımanı, özel olarak geliştirilmiş hızlandırılmış metal partiküller aracılığıyla DNA nın hedef dokuya aktarılması sağlanmaktadır[8]. Kimyasal yöntemlerden biri olan kalsiyum klorid veya kalsiyum fosfat kullanılarak yapılan trasnformasyonda hücre zarının DNA yı hücre içine alabilecek duruma getirilmesi amaçlanır. Bu yöntemlerde transformasyon başarısı oldukça düşüktür. CaCl2 kullanılan ve Escherichia coli nin kompetant olmasını sağlayan kimyasal yolda ise CaCl2 vasıtasıyla hücre zarının nötralizasyonu gerçekleştirilir ve bu sayede ilgili genin vektör içine aktarılması sağlanmaya ardından birkaç dakika süresince devam eden  42 C sıcaklık uygulanarak bu süreçte başarı sağlanması hedeflenir, ısıl şok olarak adlandırılan bu işlemin hücreye etkisi tam olarak belirlenememekle birlikte kimyasal transformasyon süreci daha yüksek başarı oranlarıyla gerçekleştirilmeye çalışılmaktadır[9].  Kimyasal yolla transformasyon yollarının bir diğeri olan polyethylene Glycol ile gen transferinde sitoplazma zarında geçirgenlik oluşup büyük moleküllerin aktarımının gerçekleşmesi elde edilmektedir[8]. Kimyasal yolların bir diğeri olan lipozomlar vasıtasıyla transformasyonda lipozomlar görev yapmaktadır. Hücre içerisinde bulunan lipit molekülleri  hücre içerisindeki moleküllerin taşınmasında rol oynamaktadır ve polyethylene glycol(PEG) ortamda mevcut ise çift katmanlı yağ molekülleriyle kaplanmış olan yabancı DNA lar konak hücrenin protoplastlarının plazma zarıyla birleşir ve sonuç olarak DNA nın sitoplazmaya girerek genoma eklenmesi gerçekleşir[8].  Elektriksel yolla transformasyon metoduyla genetik materyal aktarımında ise elektroporasyon adı verilen ve elektrik dalgaları,  enerjisi kullanılarak hücre zarının açılması sağlanır[8]. Bu yolla hücre zarı açılıp da kompetent ve yabancı DNA yı alabilecek hale getirdikten sonra elde edilen bu geçici porlardan genetik mmateryal aktarımı gerçekleştirilmesi hedeflenir[8]. Bu yöntem kimyasal yolla yapılan transformasyondan çok daha başarılı ve etkilidir.

Tüm bu yöntemlerden seçilerek uygulanan kompetanslık sağlanması ve transformasyon sürecinin ardından yapılan işlemin değerlendirilmesi aşaması gerçekleştirilmektedir. Yapılan transformasyon işlemleri her zaman umulan sonuçları vermemekle birlikte bu sürecin başarısıyla ilgili değerlendirmeler gerekli  süreçler sonunda anlaşılmaktadır. Buna örnek olarak agarose jel elektroporesis verilebilinir. Bu yöntemle önceden hazırlanmış gerekli enzimlerle kesilmiş olan DNA lar yine aynı şekilde hazırlanmış agarose jel elektophoresis tanklarına yerleştirilir ve akım uygulanıp DNA bantlaşmalarının gerekli koşullar altında incelenmesine dayanmaktadır. Bu yöntemde yabancı DNA yı kendi plasmidine kabul eden veyahut etmeyen vektörler tespit edilebilmekte ve ilerleyen çalışmalarda kullnımı açısından yol gösterici bilgiler elde edilebilmektedir.

KAYNAKÇA

[1] Kadner, R. (2020). (Bakteriler) Bacteria. Alıntı tarihi 8 Ocak 2020, http://www.academicroom.com/topics/what-is-bacteria

[2] Lehman, C., “How Many Bacteria Live on Earth?” ( Dünya’da Ne Kadar Bakteri Yaşar) sciencing.com, https://sciencing.com/how-many-bacteria-live-earth-4674401.html. 8  Ocak 2020.

[3] Aryal, S. (2020). Different Size, Shape and Arrangement of Bacterial Cells( Farklı Boyut, Şekil ve Düzendeki bakteri Hücreleri) . Alındı 8 Şubat 2020, https://microbiologyinfo.com/differehttps://microbiologyinfo.com/different-size-shape-and-arrangement-of-bacterial-cells/nt-size-shape-and-arrangement-of-bacterial-cells/

[4] Monroe, M. (2020). Plasmids 101( Plasmidler 101) : What is a plasmid?( Plasmid Nedir) . Alındı 8 Ocak 2020, from https://blog.addgene.org/plasmids-101-what-is-a-plasmid

[5]  Genomik ve Plasmid DNA arasındaki Farklar- Kıyaslamalar (Difference Between Genomic and Plasmid DNA | Compare the Difference Between Similar Terms). (2020). Alındı 8 Şubat 2020, from https://www.differencebetween.com/difference-between-genomic-and-vs-plasmid-dna/

[6] Abmayr, B. (2014). Bakteriyel Transformasyon (Bacterial Transformation). Alındı 8 Şubat 2020, from https://www.clear.rice.edu/bioc111/bios111_transformation.htm

[7] Lorenz, M., & Wackernagel, W. (1994).   Çevredeki Doğal Transformasyonla Bakteriyel Gen Transferi (Bacterial Gene Transfer by Natural Genetic Transformation  in the Environment) . Alındı  11 Şubat 2020, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372978/pdf/microrev00022-0281.pdf

[8] Yılmaz, O. (2017). Alındı  12 Şubat 2020, http://oyilmaz.org/document/rekDNA4.pdf

[9]Miller, E. M.& Nickoloff, J. A. (1995). E. Coli elektrotransformasyonu( Escherichia coli electrotransporation- In electroporation Protocols for microorganisms s. 105-113). Humana Press.