Gram Boyama Tekniği

Boyama yöntemleri genel olarak mikroskop altında bakterileri daha iyi görünür hale getirmek için kullanılır. Mikrobiyolojide kullanılan çeşitli boyama yöntemleri vardır. Bu yazıda Gram Boyama Tekniğine değinilecektir. Boyama işlemi genellikle, bakteriyel yayma preperatın ateşte fikse edilmesiyle başlanır. Boyama fiksasyon sonrasında gerçekleştirilirse cansız bakteriler, fiksasyon yapılmazsa canlı bakteriler gözlemlenir. Gram boyama tekniği ilk olarak Hans Christian Joachim Gram tarafından uygulanmış ve bakterilerin peptidoglikan yani hücre duvar yapılarına göre farklılık gösterdiği gözlemlenmiştir. Fakat Hans Christian Joachim Gram boyamasında zıt boyama aşaması yoktur. Boyama yöntemini yayınladı fakat geliştirilmesi gerektiğini söyledi. Günümüzde kullanılan yöntem Hucker tarafından geliştirilmiştir. (1921)

Gram Pozitif/Negatif durumu bakterilerin hücre duvar (peptidoglikan) yapısına bağlı bir özelliktir. Gram Pozitif ve Gram Negatif bakterilerin farkı peptidoglikandır. Gram Pozitif bakterilerin peptidoglikan yapıları, Gram Negatif bakterilere göre daha kalın ve Gram Negatiflerde bulunmayan Teikoik asitin varlığıdır. Gram Pozitif bakterileri Gram Negatiflerden
ayıran bir diğer özellik ise Gram Pozitif bakterilerin hücre çeperlerinin magnezyum ribonükleat, lipid ve karbonhidratlar boya ile zor ayrılabilen bileşikler yapmasıdır. Gram Negatif bakterilerin ise Gram Pozitif bakterilere göre birde dış membrana sahip olmalarıdır. Gram Negatif bakterilerin peptidoglikan yapısı dış membran ile iç membran arasında Gram Pozitif bakterilere göre daha ince şekildedir. Mikrobiyolojide kullanılan bu gram boyama tekniği diiferansiyel bir boyama yöntemidir ve gram boyama genellikle bakterilerin identifikasyonunda yani tanımlanmasında kullanılan bir mikrobiyolojik boyama tekniğidir. Bu boyamayı yaparken bir takım uygulamalar vardır. Bunlar sırasıyla primer boyama, mordant uygulaması, seçici uygulama, zıt boyamadır.

Primer boyama, kristal viyole ile gerçekleştirilmektedir. Kristal Viyole boyama yöntemlerinde kullanılan bir bazik boyadır. Teknikte hücresel kısımların boyanmasında kullanılır. Bu uygulama tek başına uygulanırsa bütün bakteriler mor renkli gözükür. Mordant uygulaması ise boyanın hücreye girip, peptidoglikan tabakasına bağlanmasını sağlamaktır.
Bu uygulamada renk sabitleştirici ajan olarak İyot çözeltisi kullanılır. Bu uygulamadan sonra seçici uygulama yöntemi uygulanır. Bu uygulama da preperat %96’lık alkol kullanılarak muamele edilir ve Gram Negatif bakterilerin dış zarı zayıflatılır ve boyanın uzaklaştırılması sağlanır. Bu uygulama sonunda Gram Pozitifler mor, Gram Negatifler ise renksizdir. Zıt
boyama yöntemi son uygulamadır. Safranin ile gerçekleştirilen bu uygulama Gram Negatif bakterileri boyayarak, pembe renkli görünmeleri sağlanır. Bu uygulama sonunda Gram Pozitif bakteriler hala mor renklidir.

Yöntemleri daha iyi anlamak için Klebsiella bakterisini örnek alıp, adımları inceleyelim. DİKKAT ⚠ bu bakteri patojen olup boyama yapılırken dikkat edilmesi, gerekli tedbirlerin alınması gerekir.

Yöntem:
● 24 saatlik inkübasyona bırakılan saf Klebsiella bakterisi öze yardımıyla alınır ve
bakteriyel yayma preperatı hazırlanır.
● Preperat ateşte fiksasyon ile fikse edilir.
● Preperatın üzerini tamamen kapatacak şekilde bazik boya olan kristal viyole
eklenir.
● 1 dakika bekletilir.
● 1 dakika sonrasında boya saf su ile uzaklaştırılır.
● Preperata birkaç damla iyot çözeltisi damlatılır ve 1 dakika beklenir.
● %96’lık alkol ile 5-10 sn muamele edilir.
● Saf su ile preperat nazikçe yıkanır.
● Preperatın üzerini tamamen kaplayacak şekilde, zıt boya olan safranin ile 30 sn
muamele edilir.
● Saf su ile preperat nazikçe yıkanır.
● Preperat kurumaya bırakılır ve kuruma sonrasında mikroskop altında önce 4x
sonra 10x ve 40x altında inceleme yapılır.
● Son olarak immersiyon yağı damlatılarak mikroskobun immersiyon merceği
olan 100x de inceleme yapılır.
● Gözlemler rapor edilir ve yorumlanır.

Aşağıda Klebsiella bakterisinin 10x mercek altındaki ışık mikroskobu görüntüsünü görmektesiniz. Resimden de anlaşılacağı üzere, bu bakterinin boyama sonucu pembe renge boyandığını, Gram Negatif bir bakteri olduğunu söyleyebiliriz.