GENOMDA FARKLI BİR OKUMA: YENİ NESİL DNA SEKANSLAMA (NEXT GENERATİON SEQUENCE: NGS)

GİRİŞ

1975’e kadar DNA dizilimi ve okunması oldukça zahmetli bir uğraştı. Bu tarihten sonra Frederick Sanger ve arkadaşlarının yapmış oldukları çalışmalarla genetik çağın başlamasana neden olacak DNA dizileme yöntemini buldular. Tabi bu keşif modern dizilemenin temelini oluşturdu. Fakat ilerleyen süreçlerde, özellikle Genom projesinin başlamasıyla birlikte kullanılan bu teknik oldukça zaman alıcı ve yüksek maliyetli olduğundan yeni bir metodun geliştirilmesine yön vermiştir. Bu yeni teknolojiler DNA ve RNA’yı daha önce kullanılan Sanger yöntemine göre oldukça hızlı ve maliyeti daha düşük bir dizileme imkanı sağlıyordu.
Yeni Nesil Sekanslama: ‘High-throughput sequencing’ olarak bilinen modern dizileme teknolojileri tanımlamak için kullanılan bir terimdir.

Son yıllarda geliştirilen yeni nesil DNA dizileme teknolojisi, genetik/epigenetik düzünleyici ağların, kromotin yapısı, nükleer yapılanma ve genom varyasyonları (çeşitliliği) hakkında bilgi üretimini sağlayan önemli bir araç olmuştur.
Diğer önemli ve dikkat çekici bir özelliği ise yüksek doğrulukta, ultra hızlı dizileme kapasitesine sahiptir. Bu yöntemle elde edilen bir mikrobiyal genom dizisi araştırmacılara başka hiçbir deneysel yöntem ile elde edilemeyecek kadar zengin ve özgün bilgi sağlamaktadır.
Yeni nesil DNA dizileme metodu kullanarak, de novo dizileme yöntemiyle bitki, maya, mantar ve virüs gibi farklı organizmaların genomlarını çok kısa sürede ve yüksek doğrulukla dizileme mümkündür. De novo dizileme ile genomu bilinmeyen mikro organizma, hayvan veya bitki genomu bilinebilir, elde edilen sonuçlardan hastalıkların genetik farklılıkları tanımlanabilir. Uzun ve kısa DNA dizi okuma teknolojileri birleştirilebilir, genomun uzun tekrarlı bölgeleri ve GC zengin bölgelerin doğru bir şekilde saptanabilir.
Shotgun Dizileme metodu uzun DNA parçalarını dizilemek için kullanılır. Bu metodta büyük boyutlardaki genomik DNA veya bakteri yapay kromozomları fiziksel olarak, rastgele küçük (300-800 bp) boyutlara parçalanır. Bu DNA parçacıkları, uçlarına eklenen adaptörlerden DNA yakalama boncuklan tarafından tutularak bir DNA kütüphanesi oluşturulur. Daha sonra her bir boncuk tarafından yakalanan DNA parçacığı ayrı ayrı dizilenir ve okunan bütün parçalar Biyoinformatik yazılımlarla birleştirilir. Shotgun Dizileme tekniği birçok önemli grup tarafından kullanılmıştır. Bu metod ile insan gibi karmaşık genomlardan Drosophila melanogaster genomuna ve Haemophilus influenzae gibi bakteri ve virus genomlarına uzanan birçok türün tüm genom haritası ortaya çıkarılmıştır.

Günümüzde kullanılan yeni nesil dizilemele sistemleri;

 Roche 454 Genome Analyzer
 Illumina Genome Analyzer
 Applied BioSystem SOLİD
 Complete Genomics
 Helios
 Pasific Biosciences
 Ion Torrent
Yeni nesil DNA dizileme yöntemi ile birlikte olağanüstü bir bilgi birikimi oluşmuştur. Fakat bu kadar büyük ölçekteki bilginin depolanması, analizi ve değerlendirmesi için büyük güçlükler var. Tabi bu dizileme yönteminin başarılı bir şekilde kullanılması için nitelikli biyoinformatik analiz programlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca elde edilen verilerin kısa bir sürede okunup ve hata oranı geliştirilmelidir.

YENİ NESİL DİZİLEME METODLARI

• Pirodizileme
Pirodizilemenin temeli DNA polimeraz aktivitesinin kemolüminesan bir enzim aracılığıyla tespitine dayanmaktadır. Dizileme reaksiyonu, dizilenecek DNA’nın tek sarmalı (ssDNA) üzerinde tamamlayıcı sarmalının (complementary DNA / cDNA) sentezlenmesi şeklindedir.

• Ligasyon yoluyla dizileme
Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır, problar kalıp DNA’ya hibridize olur ve primerle ligasyona girer. Floresan deteksiyonundan sonra oligonükleotid probların işaretleri 5′ fosfat ucu kesilerek yeni bir ligasyon siklusuna geçilir. Ligasyon, deteksiyon ve ayrılma sikluslan tekrarlanarak DNA dizisi belirlenir.
• Ion semikonduktor dizileme
Bu metod DNA’nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan Hidrojen iyonlarının saptanmasına dayanır. Tek bir Kalıp DNA dizisini içeren mikrokuyuya tek tip nükleotid akışı uygulanır. Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu durumda yeni oluşan ipliğin yapışma katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur. Hidrojen iyonlan hipersensitif iyon sensorleri tarafından algılanır. Kalıp DNA’da homopolimer tekrarların varlığı durumunda tek siklusta birden fazla nükleotid yeni ipliğin yapışma girecek ve salınan hidrojen iyonlarının sayışma göre daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir.
• Nano dizileme
Bu yöntem de sentez yoluyla dizileme esasına dayanır. Direkt moleküler sensör olarak, biyomühendislikle üretilmiş farklı bir polimeraz ve dNTP’ler kullanılır. Her bir nanomakinede tek bir DNA molekülünün sentezi gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

KULLANIM ALANLARI

1) METAGENOMİK

Herhangi bir çevresel örnekte olan tüm mikrobiyolojik genomların rastgele dizilenmesiyle biyolojik çeşitliliği ortaya çıkarmak için kullanılır. Çevresel ortamlarda yaşayan mikroorganizmaların miktarı hakkında bilgi verilir ve bilinmeyen mikroorganizma tespiti için kullanılır.

2) BİTKİLER VE TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ

Karmaşık bitki genomunun ve büyüklüğünün çözülmesin etkili bir metotdur. Kullanılan eski metodlar çok maliyetli ve uzun sürmesinden dolayı sadece belli dizileme merkezleriyle sınırlı kalmaktaydı. Yeni nesil dizileme yüksek doğru oranlı okumalarıyla yüksek veri kalitesi sunar. Aynı zamanda maliyet nedeniyle oldukça kullanışlıdır.

3) ATASAL DNA

Saç, tırnak, deri, saç ve eski fosillerin DNA analizi mümkün kılar.

4) TRANSKRİPTOM

Transkriptom dizileme mRNA transkripsiyon-ekspresyon analizi yen genleri keşfi henüz genom tamamıyla tanımlanmamı organizmalarda geniş bölgelerini tanımlanması, tüm genom dizisini oluşturulması tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP belirlenmesi insersiyon-delesyonlar ve splicing varyantları tespiti allel spesifik ekspresyonları analiz ve kromozoma yeni düzenlenmeleri belirlenmesin kapsar.

5) KÜÇÜK RNA’lar (small RNA’lar)

Küçük RNA’lar MicroRNA’lar endojen siRNA’lar ve Piwi-interactin RNA’ların dahi olduğu gruptur B sistem sayesinde bakteri içerisinde klonlanma yapılmadan yüzlerce hatta binlercesi tanımlanabilir ve miktar belirlenebilir Daha önc tanımlanmamı küçük RNA’lar tespit edilebilir ve farklı ekspresyon profil çıkartılabilir veya küçük RNA transkriptomla ile karşılaştırılabilir.
6) Metilasyon Analizi
Gen ekspresyonunun epigenetik düzenlemesi, geşimsel süreç için çok önemlidir. Son dönemlerde yapılan çalışmalar epigenetiksel değişimler kanser, psikolojik hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu görülmüştür.

SONUÇ

Yeni nesil DNA dizileme bariz bir şekilde genetik alanına yeni bir soluk getirmiştir. Özellikle insan genomundaki bilinmeyen ya da işlevi aydınlatılmayan uzun ve kısa tekrarları gün yüzüne çıkarmayı belli bir düzeye kadar başara bilmiştir. Fakat bu teknolojinin de kendi içinde dezavantajları bulunmaktadır. Örneğin ürettiği yüksek verinin depolanması ve sağlıklı bir şekilde değerlendirilmek gibi sorunları bulunmaktadır. Tabii en önemli bir nokta olan genetiğin kalıtsal, nörolojik hastalıklara kökten bir çözüm getirme beklentisi bu alanın yükünü ağırlaştırıyor. Kafalardaki bu sorulara cevap ya da çözüm getireceği ilerleyen teknolojik gelişimler büyük yer kaplıyor.

KAYNAKÇA

http://dergipark.gov.tr/download/article-file/304726
http://www.journals.istanbul.edu.tr/iudtaed/article/view/1023008342/1023008757
http://evrimagaci.org/article/tr/dna-dizileme-yontemleri-genleri-nasil-diziliyoruz
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3841808/

http://www.artibiyoteknoloji.com.tr/wp/de-novo-dizileme/

https://www.labome.com/method/RNA-seq-Using-Next-Generation-Sequencing.html