TRANSGENİK BİTKİ SEÇİMİ

Transgenik bir bitki nasıl analiz edilir?

Transgen başlangıçta PCR(polimeraz zincir reaksiyonu) ile araştırılır.Aktarılan genin entegrasyonunu belirliyebilmek için en son DNA hibridizasyon analizi(southern blot) yapılmalıdır.Bu işlem bitki genomuna kaç adet kopya transgen yerleştiğini belirtir.
Aktarılan genin ifadesinşi ölçebilmek için RNA hibridizasyonu (northern blot) yapılır,çoğunlukla eş zamanlı ters-transkriptaz PCR (RT-PCR) kullanılmaktadır.Northern blot transgenin ne kadar ifade edildiğini belirlemeye yarayan bir moleküler analiz yöntemidir.
Trsnsgenik olarak ifade edilen proteinin ne kadar üretildiğini western blot analizi veys ELISA yönetemi kullanılarak ölçülür.

BAŞLANGIÇ TARAMALARI:

1)Seçiçi Ortamda Tarama;
Transgenik tohumların seçiçi ajana dayanabilecek bitkileri belirlemek için petri kaplarına antibiyotikler gibi seçiçi ajanlar katılarak tohumların çimlendirilmesi sağlanır.Yabani tip bitkilerin tamamı ölür.

2)PCR
İlgili genlerin DNA izolatlarını kullanarak tarama yapılır.
PCR,genç bitkilerde veya Agrobectreium uygulamasından sonra antibiyotik uygulamadan rejenere fidanlara yapılmamalıdır.
Agrobacteriumları öldüren antibiyotikler:Karbenisilin ve sefatoksim.
Herhangi bie organizmaya ait genomik DNA’da ki özgül bölgelerin çoğaltılması (amplifikasyonu) işlemidir.

Temel aşamaları:

1)Hedef DNA’nın denatürasyonu(çift zincirli yapısının bozulması.)
2)Primerlerin bağlanması
3)Polimerizasyon(kalıp DNA’nın çoğaltılması)
İşlemleri sırası ile gerçekleştirilir.Lakin bu işlemler için gerekli olan 6 önemli unsur bulunmaktadır.
-kalıp dna
-primer
-TaqDna polimeraz
-dNTP
-MgCl ve diğer tamponlar
-dH2O kullanılmalıdır.
NOT: PCR ürününün görüntülenmesİ Agaroz jel elektroforezİ İle olur.
3)ELISA
Antijen-antikor ilişkisini kullanarak ,antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırma temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir.

TANIMLAYICI MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU:

1)Tam Transgen Entegrasyonu
Kopya sayısı yada transgenin bitki genomuna kaç kez eklendiği southern blot analizi ile kanıtlanır.
-Southern blot nasıl yapılır?
-Dna izolasyonu
-Dna’nın restriksiyon enzimleri ile kesimi
-Kesilen parçaların elektiroforezde yürütülmesi
-Dna denatürasyonu
-Denatüre edilen parçaların nitroselüloz nalyon membrana transfer edilmesi
-Ön hibridisazyon(BSA,süt tozu,farklı DNA)
-Hibridizasyon için etiketli prob ilavesi
-Bağlanmayan probların yıkanması
-Membranın X-ray film ile kaplanması
-Otoradyografik görüntüleme ile işlem sonlandırılır.
2)TRANSGEN İFADESİ:TRANSKRİPSİYON
2.1)Northern blot
mRNA seviyesinde transkript belirleme ,bunun miktarını tayin etme ve dokuya özel transgenin ifadesinin gözlenmesi için tamamlayıcı problarla hibridizsyson esasına dayanır.
-Northern blot nasıl yapılır?
-Rnaz kontaminasyonundan kaçınılmalıdır.
-mRna’ların kendi üzerlerine katlanmadan kaçınmak için formaldehit eklenir.
-Jel membrana blotlanır.
-Transkript probla hibridize edilir
-Membran yıkanır
-Görünrüntüleme yapılır.
2.2)Kantitatif eş zamanlı ters-transkriptaz PCR(RT-PCR)
Gen ifadesinin miktarının belirlenmesinde ve gözlenmesinde bir araç olarak ters transkriptaz resksiyonu,RT-PCR’ın gücü ile birleştirilir.
-Northen Blot nasıl yapılır?
-Total RNA veya mRNA izole edilerek ters transkriptaz enzimi ile cDNA’ya çevrilir.
-Kalıp olarak kullanılan cDNA,Taq DNA polimeraz ile çoğaltılırken flouresan boya biriken PCR ürünleri görüntülenir.
3)TRANSGEN İFADESİ;WESTREN BLOT ANALİZİ;
İlgilenilen genin transgenik bitkide rekombinant protein oluşumuna sebep olduğunu gösteren analizdir.İlgili proteinin üretilip üretilmediğini veya doğru bir şekilde işlenip işlenmediğini görebiliriz.
-Western blot nasıl yapılır?
-Protein izole edilir ve poliakrilamit jel üzerinde ayrılır.
-Jel nitroselüloz veya PCDF membrana transfer edilir.
-Membran antikorlarla musmmele edilip görüntülenir.
4)DİJİTAL GÖRÜNTÜLEME
5)FENOTİPİK ANALİZ
Yapılarak bir bitkinin transgenik olup olmağı anlaşılabilir ve aktarılar genin aktarılıp ne kadar ürün verdiğine bakılır.

Muhammed bayram BABACAN
Atatürk Üniversitesi.

Kaynak:

MOLEKÜLER HÜCRE BİYOLOJİSİ.
BİTKİ ISLAHI VE GENETİĞİ
MEDİCAL MİCROBİOLOGY